Captura y aislamiento de proteínas que se unen al espaciador menor del locus de calmodulina de Trypanosoma cruzi
Trypanosoma cruzi es el parásito protozoario causante de la enfermedad de Chagas, una enfermedad endémica en Panamá. En este parásito, el proceso de regulación de la expresión génica es principalmente un proceso postranscripcional. Se ha sugerido que las proteínas de unión al ARN (RBP) tienen un pa...
| Autor Principal: | Jaén, Luis Angel |
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| Formato: | Tesis |
| Idioma: | Español |
| Publicado: |
2022
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| Materias: | |
| Acceso en línea: |
http://up-rid.up.ac.pa/5757/ http://up-rid.up.ac.pa/5757/1/luis_jaen.pdf |
| Sumario: |
Trypanosoma cruzi es el parásito protozoario causante de la enfermedad de Chagas, una enfermedad endémica en Panamá. En este parásito, el proceso de regulación de la expresión génica es principalmente un proceso postranscripcional. Se ha sugerido que las proteínas de
unión al ARN (RBP) tienen un papel clave en esta regulación génica. La calmodulina es una proteína censora de calcio altamente conservada, codificada por tres genes separados por dos espaciadores intergénicos (espaciador mayor y menor). El estudio de las bases moleculares que
llevaron a las interacciones ARN-proteínas en T. cruzi podría contribuir a comprender la biología del parásito y desarrollar estrategias novedosas para el control de la enfermedad de
Chagas. En este estudio desarrollamos una estrategia basada en una reacción en cadena de polimerasa (PCR) recursiva para insertar un aptámero de alta afinidad de estreptavidina en la secuencia del espaciador menor, para utilizarlo en una metodología de captura de proteínas. La secuencia completa del locus de calmodulina se descargó de GenBank (AAHK01001263.1). La secuencia del aptámero S1 (83 pb) reportada en publicaciones anteriores se manipuló para el
diseño de los cebadores. Las secuencias se editaron con el software bioinformático UGENE. La secuencia del espaciador menor del locus de calmodulina (EMLC) se fragmentó en dos regiones.
Los cebadores se diseñaron para flanquear las dos regiones, cada uno con los oligonucleótidos internos directo / inverso unidos a secuencias de medio aptámero. La PCR recursiva final pudo amplificar el espaciador menor de calmodulina incorporando el aptámero. Posteriormente Realizamos una trascripción in vitro del producto amplificado y este transcrito fue utilizado para el desarrollo de la metodología pull down. Los resultados de nuestro ensayo de captura se
visualizaron mediante electroforesis de proteína SDS page, evidenciando la presencia de proteínas afines al transcripto del espaciador menor de calmodulina. La metodología pull down desarrollada en este estudio representa una herramienta útil para capturar proteínas que interactúen con motivos de ARN |
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